分离提纯的蜜环菌菌种，一因数量太少，二因用培养基培养的蜜环菌对菌材没有适应性，直接用在菌材上繁殖，不但长不好，还将因不能萌发而死亡。故试管种必须进行适应性培养和扩大培养。这一过程就叫蜜环菌的二级培养，也叫原种培养。
原种的数量根据栽培种的数量来确定。生产季节是栽培种生产的时间提前2个月。
蜜环菌培养料配方
配方1：阔叶树木屑70%，麸皮28%，石膏1%，碳酸钙1%。
配方2：木屑90%，麸皮4%，淀粉4%，石膏1%，碳酸钙1%。
配方3：玉米芯0%，阔叶树木屑50%，麸皮18%，石膏1%，碳酸钙1%。
配方4：棉子壳30%，木屑40%，麸皮28%，石膏1%，碳酸钙1%。
配方5：阔叶树木粒50%，木屑40%，玉米粉8%，石膏1%，碳酸钙1%。
配方6：阔叶树木粒60%，细木屑30%，黄豆粉8%，石膏1%，碳酸钙1%。
配方中的黄豆粉、玉米粉、麸皮、淀粉等有机氮源可以按照适当比例混合使用，效果更佳。
培养料的 pH 为自然值，加入干料1:0.5的水进行拌料。
在生产设备、接种技术和设备、培养条件等均很好的场地，可以另外添加1%~2％的红糖、蔗糖，操作技术和设备不理加的场地，最好不要添加糖，以免增加菌种高比例污染的风险。
可以在菌种瓶内直接加入少量琼脂，让水和培养基全部变成凝胶的固体状态，菌丝体和菌索生长速度快。原种在运输过程中倒放、横放，不会有液体流出，不会因为瓶口和瓶外的液体回流带来污染杂菌的风险。
原种的容器一般使用750mL的玻璃瓶、塑料瓶，也可以使用250mL、500mL的输液瓶。一般不用罐头瓶，其瓶口太大，长时间培养，污染率会提高。
每一个菌种瓶中先加入5~8g琼脂，原料拌均匀以后即可装瓶，用棒压紧培养料。然后在瓶中装入清水，水位到瓶肩即可。
清洗瓶体外部，晾干。塞上棉塞或瓶盖，宜用封口膜加橡皮筋封口。放入灭菌筐内，送到高压锅中进行灭菌。