灵芝孢子分离法也称为孢子弹射分离法，是利用某些灵芝子实体成熟后自行弹射孢子的特性，在无菌条件下，使弹射的孢子落到适宜的培养基上，在适宜的条件下进行培养，孢子萌发成菌丝，而获得纯菌种的一种方法。近期有网友咨询耕种帮：灵芝菌种的孢子如何分离？灵芝菌种的孢子分离步骤是怎么样？
1、分离材料的选择与消毒
灵芝孢子分离的材料，来自于多年人工栽培的优良品系和野生的种。在同一个生长条件下，栽培同一种灵芝不同的品系，其生产效益和品质有很大差异；而同一个品系栽培在不同的环境条件下，其优良性状表现也不同，就是在相同环境条件下栽培的同一个品系，其单株之间也会出现差异。因此，应选择长期栽培优良品种的优良单株，作为分离材料。野生的菌株，未经过人工栽培，不知其优良性状、抗逆能力和生产性能如何，只能作为育种搜集原始材料时进行孢子分离，经过培养品系之间对比试验，选择优良者进行孢子分离，经过培养品系之间对比试验，选择优良者进行生产，在选优去劣的培养过程中，再在群体中选择优良个体，作为孢子分离的材料。
理想的用于分离的灵芝子实体，应该是具有该品种主要典型的特征，发育正常，个体健壮，无病虫害，成熟适度的子实体。选定后，及时采摘进行消毒。可剪去菌柄的2/3，用清水洗去沾附的污物，浸入0.1%的升汞溶液中1~2分钟或70%的酒精浸几秒到1分钟，取出后用无菌水反复冲洗数次，用灭菌的纱布或滤纸吸干表面水分后待用。
2、灵芝孢子的采集
用于分离的灵芝子实体经消毒处理后，即可采用孢子弹射法收集孢子，即利用孢子自动弹射出子实层的特性，采集孢子。一般采用全部操作过程都应该在无菌条件下进行。
①贴附法。取一块经消毒的成熟子实体，用灭菌的琼脂或浆糊，黏附在装有PDA培养基的试管斜面或培养皿皿盖正上方，加棉塞或盖皿盖后置室温下培养，待孢子自然落下后，在无菌室内镊除子实体小块，或将落有孢子的培养基转移在新的试管斜面及培养皿平板培养基上，加塞或加盖后继续培养。
②孢子印采集法。取成熟的子实体经表面消毒后，切去菌柄，置于灭过菌的白色或黑色蜡光纸上，罩上通气钟罩，在24℃下静置数小时后，轻轻移去子实体，可见有大量孢子落在纸上。将有孢子印的纸在无菌条件下保存备用。
③空中孢子捕捉法。灵芝子实体成熟后，孢子大量弹射，在子实体周围可见烟雾状的“孢子云”，将准备好的培养基平板或试管口迎着“孢子云”方向，使孢子附着在培养基表面，随即盖下皿盖或加棉塞即可。
3、灵芝孢子的分离
采集到的孢子，一般需要经过分离选择后，才能制作原种。孢子的分离根据接种到培养基上的孢子数量而分单孢分离和多孢分离两种。灵芝的孢子分离多采用多孢分离法。多孢分离方法简单、易操作，没有不孕现象，在生产上常采用。多孢分离因采收孢子的方式不同，可分直接培养法、斜面划线法、涂布分离法。
①直接培养法。采用孢子弹射分离法、菌褶涂抹法及捕捉法收集到培养基上的孢子，直接放在25℃下培养，待孢子萌发后挑选特征典型的菌落，转接培养即可。
②斜面划线法。在无菌条件下，用接种针沾取少量收集到的孢子，在PDA斜面培养基上自下而上划线，划线时不要太用力，以能划破培养基表面力度。接种后加棉塞，置适温下培养，待孢子萌发后，挑选萌发早，生长旺盛的菌落，转接到新试管斜面培养基上再行培养即可。
③涂布分离法。在无菌条件下，用接种环挑取少许收集到的孢子，装入有无菌水的试管中，充分摇匀制成孢子悬浮液，然后用无菌的注射器或滴管，吸取孢子悬浮液，注入1~2滴于斜面或平板培养基表面，用无菌接种环涂匀，置适温下培养。孢子萌发后，挑选发育匀称，生长快的菌落，再移接到新试管斜面培养基上，恒温培养即得母种。
为了进行菌丝观察或育种少量也采用单孢分离：即从采集到的孢子群中，挑出单个孢子进行培养，单独萌发成菌丝而获得纯菌种的方法。按分离手段可分为稀释法、划线法、毛细管分离法和器械分离法。