为获得单一的、纯度高的灵芝菌种，就需要通过生物学手段，将灵芝从混杂的微生物群中分离出来。
灵芝菌种组织分离法
采用灵芝的幼蕾或菌盖幼组织进行分离，获得纯菌丝的方法。它们具有较强的再生能力和保持亲本种性的能力，属于无性繁殖范畴。组织分离取材广泛、操作简便、易于成功，是灵芝纯菌种的简便分离方法。
1、幼蕾分离：切取灵芝菌柄先端膨大的幼蕾，在无菌条件下，用75%酒精棉球擦拭，再用灼烧后的刀片从柄部浅切1刀，掰开两半后用锋利的接种刀挑切取幼蕾内菌肉1小块，移接至斜面中央，28℃下遮光培养，菌丝长满斜面即为母种。
2、菌盖分离：选取子实体生长正常、健壮和未成熟的子实体，切去菌柄，用75%酒精棉球擦拭菌盖正反面，然后在菌盖边缘黄白色生长圈处，切破皮壳，掰下幼嫩菌盖1块，用灼烧后的解剖刀在断面菌肉上作纵横切割成米粒大的组织片，置无菌培养皿内，最后用接种刀将组织片移接至斜面上，28℃下遮光培养。整个操作需严格无菌条件下进行。